Peprotech重組細(xì)胞因子和蛋白-常見問題解答(FAQ)

1．PeproTech細(xì)胞因子和蛋白產(chǎn)品的穩(wěn)定性如何？
     答：除非在產(chǎn)品說明書中特別注明，PeproTech的所有產(chǎn)品均為凍干粉，它們在室溫條件下非常穩(wěn)定(至少1個月)。盡管如此，我們還是建議您在收到我們的產(chǎn)品后保存于-20℃，以確保蛋白100%的活性。對于大多數(shù)蛋白，重懸后在4℃僅能短期保存(約1周)。如想長期保存，請先配制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白，如0.1% BSA，5%HSA，或10% FBS)，然后分裝凍存于-20℃或-80℃。一定要避免反復(fù)凍融，因每次凍融均會引起蛋白的部分失活。。

2．為什么有時在管中看不到細(xì)胞因子或蛋白的凍干粉？
      答： 與市場上的許多蛋白產(chǎn)品不同，PeproTech的產(chǎn)品中均不含載體蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA)和蔗糖等，并且是以zui低含鹽量的溶液進行凍干的，因此凍干后常常不能形成白色網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而是微量的蛋白在凍干過程中沉積在管內(nèi)，形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。打開管蓋前，我們建議您在小離心機中快速離心20-30秒，使附著在管蓋或管壁上的蛋白聚集于管底。我們的質(zhì)控步驟保證每管中所含的蛋白量準(zhǔn)確無誤，雖然有時您無法看到蛋白色粉末，但管中的蛋白含量仍是非常的。

3．ED₅₀和units/mg之間有何關(guān)聯(lián)？
      答： ED₅₀為半數(shù)有效濃度，其定義是可誘導(dǎo)50%zui大反應(yīng)的細(xì)胞因子濃度，這種活性表示法僅適用于劑量反應(yīng)曲線呈S形的細(xì)胞因子。其實，可以將ED₅₀的值接理解為1unit。如某種細(xì)胞因子或蛋白的ED₅₀為1ng/ml，那么1ng/ml即可看作是1unit。那么我們也不難理解，1mg(1x10⁶ng) 該細(xì)胞因子或蛋白中應(yīng)含1x10⁶/1= 10⁶units. ED₅₀(ng/ml)轉(zhuǎn)化為units/mg的公式如下：

 

4．如何確定細(xì)胞因子的種屬交叉活性？
    答：1) 除少數(shù)例外，大多數(shù)人類細(xì)胞因子對小鼠細(xì)胞均有活性。2) 許多小鼠細(xì)胞因子也可作用于人類細(xì)胞，但比活性可能低于對應(yīng)的人類細(xì)胞因子。 3) IL-7等為數(shù)不多的人類細(xì)胞因子作用于小鼠細(xì)胞時比對應(yīng)的小鼠細(xì)胞因子活性更強。4) 干擾素，GM-CSF, IL-3和IL-4等細(xì)胞因子種屬特異，對非同源細(xì)胞幾乎沒有活性。5) 相反，成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)和神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophins)高度保守，在不同動物種屬細(xì)胞上均具有很好的活性。

5．到底什么是無動物成分(Animal-Free)的重組蛋白？
      答：誠然，PeproTech生產(chǎn)的重組蛋白均是人或小鼠和大鼠的，又怎么說成是Animal-Free，即無動物成分的呢？真正的原因是：這里的Animal-Free是指在表達(dá)人、小鼠或大鼠的重組蛋白的過程中未使用任何動物來源的材料，而不是指被表達(dá)的重組蛋白是Animal-Free的。我們知道，重組蛋白通常是用大腸桿菌表達(dá)的，而大腸桿菌的培養(yǎng)基中需要添加胰蛋白胨(Trypton)等動物來源的組分，這些組分不可避免的在隨后表達(dá)出來的重組蛋白中摻入諸多不明的動物成分。雖然zui后純化出來的重組蛋白的純度可達(dá)98%或99%，但另外1%中很可能含有來自胰蛋白胨的其它動物成分，這些動物成分雖然含量極微，但可能在重組蛋白應(yīng)用于人體或動物時，將其中所含動物病原體(如瘋牛病病毒及其它未知病原體)傳染給人和動物。而且，這些動物成分中的異源蛋白也會引起人和動物的異體排斥或過敏反應(yīng)。因此，當(dāng)重組蛋白在應(yīng)用過程中可能接觸到人體或動物體時(如細(xì)胞治療和動物體內(nèi)實驗等)，請盡量選用Animal-Free的重組蛋白。

 PeproTech的無動物成分重組蛋白是在獨立的*無動物成分的生產(chǎn)車間中生產(chǎn)出來的，同時生產(chǎn)過程中不會使用到胰蛋白胨等任何含動物成分的培養(yǎng)基或試劑，因此可保證zui終的重組蛋白中不含任何動物成分，非常適合于臨床前試驗和動物研究。

 PeproTech的無動物成分產(chǎn)品的產(chǎn)品編號均以AF為前綴。PeproTech現(xiàn)已有44種無動物成分的人、小鼠和大鼠重組蛋白，并在不斷快速增加。而且有些常用的細(xì)胞因子，如人EGF(表皮生長因子)已經(jīng)*采用無動物成分的生產(chǎn)方式，即不再提供含動物成分的人EGF。

PeproTech細(xì)胞因子和重組蛋白溶解必讀（一）

我們知道，PeproTech的所有細(xì)胞因子和蛋白均為凍干粉，這使得運輸非常便捷，只要常溫即可。而且，細(xì)胞因子和蛋白凍干粉非常穩(wěn)定，在-20^℃或-80^℃條件下可保存數(shù)年。凍干粉在使用前需進行溶解，然后以液體形式加到培養(yǎng)體系或注射入動物體內(nèi)。溶解步驟非常關(guān)鍵，因溶解不好會導(dǎo)致細(xì)胞因子或蛋白的失活，這也是很多用戶在實際使用中經(jīng)常遇到的問題。
       那么，應(yīng)該如何進行正確的溶解呢？
      下面我們以Recombinant Human IL-4 (重組人IL-4，產(chǎn)品編號：200-04)的說明書為例，對細(xì)胞因子或蛋白的溶解方法進行詳細(xì)的闡述。
       拿到重組人IL-4的說明書后，您會發(fā)現(xiàn)有一段關(guān)于Reconstitution(重懸)的敘述，這段內(nèi)容含有溶解相關(guān)的所有信息。
    1. Centrifuge the vial prior to opening
          第1步：開蓋前離心試劑管
          PeproTech的細(xì)胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中，為無菌包裝。凍干粉在運輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉*溶解。

     有很多用戶會問一個問題，即應(yīng)該用多少轉(zhuǎn)速、多長時間離心試劑管，才能達(dá)到良好的收集效果？
          答：有些小型高速離心機(多為進口品牌)的面板上有一個Spin鍵，按了此鍵后，離心機會自動快速上升到其zui大速度(10000rpm或12000rpm)，上升到zui高點后速度即刻下降，直至停止旋轉(zhuǎn)，整個過程大約30s。這個Spin鍵足以很好的將細(xì)胞因子或蛋白收集到管底。但有些實驗室沒有這樣的高速離心機，只有zui高轉(zhuǎn)速為4000-4500rpm的離心機。這種情況下，需3000-3500rpm離心5min，也能達(dá)到類似的效果。
    
     2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do notvortex.
           第2步：用無菌水重懸至0.1-1.0 mg/ml，不可振蕩。 這個步驟即為溶解步驟，非常重要。
     1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉
      用于溶解細(xì)胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人IL-4需用水溶解，而重組人IL-2 (產(chǎn)品編號：200-02)則需用100mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重組人TGF-beta1(產(chǎn)品編號：100-21)需用10mMCitric Acid (檸檬酸)，pH3.0溶解，重組人FGF-basic(產(chǎn)品編號：100-18B)需用5mMTris，pH7.6溶解，重組人FGF-10(產(chǎn)品編號：100-26)需用5mMSodium Phosphate(磷酸鈉)，pH7.4溶解，重組IL-13(產(chǎn)品編號：200-13)需用20mMMHCl溶解。(注：即使同一重組細(xì)胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。具體應(yīng)該如何溶解應(yīng)以相應(yīng)批次的說明書為準(zhǔn))。后續(xù)的文章中將對各種溶解液的配制方法進行詳細(xì)的闡述，望繼續(xù)關(guān)注。
          經(jīng)常有用戶會問，為什么會有這么多種溶解方法？
          答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強度。PeproTech的細(xì)胞因子或重組蛋白在出廠前均經(jīng)嚴(yán)格測試，說明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白*溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強度與說明書中所標(biāo)明的不符，很多時候會造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能*溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。 
           有不少用戶沒注意說明書上的描述，而是根據(jù)習(xí)慣，直接用PBS或培養(yǎng)液(1640或DMEM等)等溶解細(xì)胞因子或蛋白的凍干粉。這樣做可以嗎？
           答：有時可以，要看具體情況。PeproTech的大多數(shù)細(xì)胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是PBS，此時千萬不能用PBS或培養(yǎng)液直接來溶解，具體原因在上面已經(jīng)敘述過。而有部分細(xì)胞因子，如重組人KGF(產(chǎn)品編號：100-19)和重組人FGF-23(產(chǎn)品編號：100-52)等，說明書上的溶解液即為1x PBS，此時用PBS溶解*沒問題，那么用培養(yǎng)液溶解也是可以的，不過還是用先用PBS溶解，然后再用培養(yǎng)液稀釋。
          2) 一定要溶解到的濃度。
              蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個范圍就是說明書上所標(biāo)明的濃度范圍，該例為0.1-1.0mg/ml。這個濃度范圍對于不同的細(xì)胞因子或重組蛋白是不同的。如重組人FGF-6(產(chǎn)品編號：100-30)為0.5-1.0mg/ml，而重組人ActivinB(產(chǎn)品編號：120-15)則一定要是0.5mg/ml。
            高于或低于該濃度范圍會有什么問題呢？
             答：首先，細(xì)胞因子或蛋白會不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個濃度范圍，可能會超過該蛋白的zui大溶解濃度，即蛋白無法*溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會出現(xiàn)聚集(aggregation)，zui終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。
          3) 一定不能振蕩(vortex)。
             這里所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩。
            有用戶會問，若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實現(xiàn)細(xì)胞因子或重組蛋白的*溶解，該怎么辦呢？
             答：多數(shù)細(xì)胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細(xì)胞因子或重組蛋白*溶解。
             對于不易溶解的細(xì)胞因子或蛋白，PeproTech會在說明書中進行備注(Note)。如在重組人IL-13(產(chǎn)品編號：200-13)的說明書中您會看到：Slow todissolve (緩慢溶解)，在重組人IL-11(產(chǎn)品編號：200-11)的說明中會看到： Thissolution is slow to dissolve.(該溶液溶解緩慢)。這種情況下，您能將要溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白放在水平搖床(shaker)上低速搖一段時間，促使細(xì)胞因子或重組蛋白*溶解。
           有些蛋白，如重組人IL-13 Variant (產(chǎn)品編號：200-13A)雖然難溶，但卻不需用搖床來加速溶解。其說明書上的備注為：Allowthe reconstituted vial to sit at 4℃ for at > 2 hours before use. (將重懸液在4℃靜置2小時以上)
          
         3. This solution can be stored at 2-8^℃ for up to 1week.         
              第3步：該重懸液在2-8^℃zui長可保存1周。
           用說明書上推薦的溶液將細(xì)胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細(xì)胞因子或重組蛋白可放置在2-8^℃，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細(xì)胞因子或重組蛋白的活性zui長可保持1周。這對一個周期為5-7天的實驗，如DC(樹突狀細(xì)胞)的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。
         其實，說明書上推薦的濃度對于一般的實驗來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進一步稀釋后再放在4^℃保存，待1周內(nèi)用完。如進行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進行稀釋，否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很容易會粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度下降，細(xì)胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。
       
        4. For extended storage, it is recommended to further dilute in abuffer containing a carrier protein (example 0.1% BSA) and store in workingaliquots at -20^℃ to -80^℃.
              第4步：如要長期保存，則需用含載體蛋白(如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA)的溶液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20^℃至-80^℃。
            如果一個實驗周期長于一周，或配制的細(xì)胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對細(xì)胞因子或重組蛋白進行長期保存。方法是：將已重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1%BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20^℃至-80^℃，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。
          經(jīng)常有人會在細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后直接分裝凍存于-20^℃至-80^℃，這樣可以嗎？
           答：不行。我們知道，塑料管壁對多數(shù)蛋白均有很好的吸附作用，也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后，蛋白是很難與管壁分離的。做過ELISA實驗的人都知道，ELISA的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶標(biāo)板上的。
     載體蛋白，如1% BSA，10% FBS(胎牛血清)和5% HSA等 的主要作用是預(yù)先封閉塑料管壁上的蛋白結(jié)合位點，使細(xì)胞因子或重組蛋白不會粘附于管壁。如果在細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白 的溶液進一步稀釋，而直接分裝凍存，則溶液中的大部分細(xì)胞因子或重組蛋白均會粘附到管壁上，導(dǎo)致溶液中實際溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度大為降低，zui終 表現(xiàn)為細(xì)胞因子或重組蛋白活性的下降。
       因此，在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進一步稀釋。稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細(xì)胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。
         那么，含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢？水可以嗎？
          答：水不可。該溶液通常是指pH近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS，培養(yǎng)液(RPMI1640, DMEM等)等。
          還有一個經(jīng)常被問及的問題，即在做無血清培養(yǎng)或動物的體內(nèi)實驗時，細(xì)胞因子中不能含有BSA，FBS或HSA等動物或人的蛋白，要想長期保存細(xì)胞因子或重組蛋白該怎么辦呢？
         答：一種方法是訂購PeproTech的小包裝(size A)細(xì)胞因子或重組蛋白，每次使用一只，用后即廢棄。如覺得該方法過于浪費，則可用海藻糖(Trehalose)作為載體，用含海藻糖的溶液來稀釋已重懸的細(xì)胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。
   
         總之，為保證細(xì)胞因子或重組蛋白凍干份在重懸后仍能保持良好的生物活性，必須按照說明書中Reconstitution的方法嚴(yán)格操作。
         蛋白有價，實驗無價，愿大家珍惜每次實驗機會，嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真，每次均能得到預(yù)期的實驗結(jié)果！